在《显微基础丨微生物观察方法》的文章中，我已经介绍了简单的采集和保存方案，但那种方案仅限于观察和初步鉴定，如果想培养的话，因为采集微生物的数量稀少从而效果不理想。
所以这篇文章的主要内容就是提供一套方案，可以进行采集、鉴定、培养的一整套玩法。
首先说一嘴，我自己都还没试过呢哈哈，目前这篇文章就停留在理论层面，还需要各位同学一起尝试。
本文的主要参考书：
- 沈韫芬; 中国原生动物学会 (1999): 《原生动物学》. 北京: 科学出版社.
- 傅华龙; 陈昭麟; 谢琳; 罗通; 兰利琼 (1993): 《藻类学教程》. 成都: 四川大学出版社.
- 厦门水产学院水生物教研组 (1980): 《淡水习见藻类》. 北京: 农业出版社.
- The World of Protozoa, Rotifera, Nematoda and Oligochaeta, National Institute for Environmental Studies, Japan
一、微生物的采集
微生物的适应性极强，在自然界中的分布极其广泛，只要水多，必然会有成群结队的微生物，比如淡水、咸水、温泉、冰雪、甚至植物的浆液，动物或人类的血液、淋巴液和体液等。
1.1 一些常规知识
a. 受污染的或者其他具有腐臭味的水体，很可能存在着相当特别的微生物群体。但并不推荐爱好者们取材，水体脏臭说明可能有一些极端环境的致病菌大量繁殖，咱们爱好者就别难为自己了。
b. 含有大量硫化氢、颜色发黑并发出臭鸡蛋气味的水体，毒性太大，没啥微生物，但也可以采集到一些特殊的耐污、耐毒种类。同样不推荐。
c. 大部分比较大个的微生物都需要水体各成分稳定，尤其是各气体成分不能失衡。所以在保存和培养过程中要注意饵料食物和水的比例问题。
d. 自然水体中，因为各种微生物的习性不同，所以会在不同的水质、深度和基底材料处聚集，所以应先了解和探索目标微生物的生态习性，再设法找对应的生境进行采集。
e. 常用的采集容器是500~1000mL的广口有盖瓶子。塑料的比较方便。采集时装上半瓶水样并加上少量的基质材料和藻类碎屑。
f. 温度是一个关键性的限制因素。大的好看的微生物生活的最适宜温度一般是18~22℃，可以根据当地日平均温和月平均温来拟定采样规划。
g. 有些微生物是和其他动植物共生在一起的，采集这种微生物就需要去蹭蹭钓友、鱼友、龟友、虫友、花友等爱好者的活动。
h. 无论在什么地方，一个水体长期不受化学物质或有机物质的污染，它里面的微生物一定很丰富。
1.2 采集微生物的常见地点
一般在野外采集微生物，可以着眼于以下几点：
- 流速缓慢、水较浅，两边和底部长有青苔或藻类的小溪流。
- 水质较清，长有水生植物的池塘和小河。
- 长有水藻的田间积水沟渠。
- 寺庙、公园内的长有水生植物的水池。
- 海岸边潮间带退潮留下的临时积水坑洼或潮洞，特别是长有海生藻类的地方。
- 积水的树洞。森林、山沟、蔬菜地里腐殖质较丰富的土壤、腐烂枝叶、苔藓植物中。
- 楼房楼顶的积水处。
不难看出，采集微生物的常见地点都离不开藻类。
因为藻类是生态系统中的生产者，没有稳定的生产者，就难以供养其繁荣的微生物社区。
1.3 采集微生物的方法
这里不介绍专业的、生态监测用途的方法，所以本方法不涉及定量的部分。仅限爱好者使用。
1.3.1 需要的物品：
- 手机：用来记录采样地点和当地生境。
- 采样容器：带盖的瓶子或大离心管。
- 粗标签笔：用来给瓶子编号。
- 如果要采集特殊的目标微生物，团絮状丝藻需要剪刀，比较大型的快速运动的微生物需要25号的网，阴湿处和土壤样品则需要新油纸。
1.3.2 采集的步骤如下：
①先在取样地点拍照，尽量将水域周围的环境、水的颜色、水中藻类都拍清楚，作为采样地点的记录和留念。这种实地宏观的记录和显微镜下微观的记录同样重要，一定要重视这一步。
②然后用手机建立一页备忘录，将取样的(a)具体地点名称，(b)地图软件的位置截图，和(c)上一步拍的生境照片放进去。
③取出采样的容器，使用粗标签笔进行编号，然后记到上一步的备忘录中。
④先装半瓶清水，不要装满，留1/2到1/4的空气以保证运输过程中不会憋死微生物。
⑤再装一些水样中的石头和藻类、在底部尽量营造原始生境。不要取泥沙（但也不用刻意清洗带泥沙的石头，因为那可能不是泥沙。它可能是某些藻类形成的絮状物），在坐车回程的途中难免摇晃，水体浑浊对一些微生物不利。
⑥采集目标微生物，如果是
(a)团絮状丝藻，则需要将尽量保持藻体完整，不要用力撕扯。尽量取完整的一团，如果附着在石头或植物上，尽量把石头一起放入容器，植物可以切出附着的一段一起放入容器。
(b)底栖型藻类，则多取些附着的石头，取完以后，需要及时保温，这种水底的生物对温度更敏感。
(c)比较大型的快速运动的微生物，则需要用小网眼的网（25号）进行捞取，多捞几次能显著提高这种大型微生物的密度。带回途中需要保证瓶内留有足够空气，如果运输时间较长，则需要投入几个麦粒（1~2粒/250mL）来保证食物供应。
(d)阴湿处的样品，如阴湿的墙角砖块，树荫下湿润的残枝落叶或苔藓植物。这种东西需要用新油纸（不透水，干净，透气）包一块，带回室内后用池塘水浸泡一段时间后即可观察到微生物。这类样品需要尽快处理，时间长了就彻底干了。
(e)土壤样品。如肥沃、富含腐殖质和团粒结构好的土壤。取材之前要去除比较干燥的表层，挖取一些湿润的土壤，用新油纸（不透水，干净，透气）包好带回，室内处理方法同上一段。
(f)鱼类寄生原生动物。见《原生动物学》P513。
⑦运输带回。这一步需要严格控制温度，并保证瓶内至少留有1/4的空气。尽量少摇晃。
二、微生物的培养
微生物培养的方法可以分为两种：第一种方法不分离微生物，所有微生物连着采回来的水一起培养，叫做混合培养法。第二种方法是挑取同种的微生物，进行纯培养。
2.1 需要的物品
除了常规配件之外，需要的特殊物品有
①麦粒。就是小麦粒，作为微生物的食物。注意这个不是小麦种子，用来种植的小麦种子是有种衣的，会杀死微生物。 ②微吸管，这里我提供一种制作简易塑料微吸管的方案，由寰宇微渺首创。（视频10:32处介绍了制作的方法） ③凹玻片，用来盛放水滴。 ④潮湿房：在干净的保鲜盒内，薄薄铺上一层脱脂棉花，加蒸馏水使棉花吸足水分，但不是浸泡在水里，再在棉花层放置两段大小适中的玻璃棒作为凹玻片的搁架，盖好保鲜盒盖子，这就是一个潮湿房。
注：现在有现成的盒子可以买，在购物平台搜索”湿盒 组化“关键词，就可以查到这种东西：
添加图片注释，不超过 140 字（可选）
作者已经亲测，确实非常好用，里面如上述放上棉花和水就行，而且很便宜，建议大家都买一个玩。
⑤小碟子。用来继续培养用的小碟子，大小控制在可以放入潮湿房。
2.2 混合培养法
尽量模拟野外的生存环境，通过添加一定的食物来维持食物链关系。
这种方法其实就是野采，然后开了一个鱼缸，只不过我们养的不是鱼虾，而是微生物。
因为容器内食物比野外丰盛，所以短时间内会使得一些物种繁盛起来，之后的时间里，容器内会进行演替，不同的时间段，占优势的物种也会不同。
最终会导致水质越来越差，所以这种培养一般只能维持7~10天左右。
具体方法：
①采样完毕拿回室内后，如果要培养：
（a）藻类：无需添加食物。用双层纱布蒙住瓶口，通风的同时防止蚊虫进入产卵。根据目标藻类的习性，严格控制温度的同时，补充合适的光照，
（b）除藻类以外的微生物：将4~5粒小麦切成两半，放入瓶子内作为食物，然后再用双层纱布蒙住瓶口，通风的同时防止蚊虫进入产卵。
这一步的实质是：创造一个食物比较丰盛的环境，从而让不同微生物之间激烈竞争，这种竞争的过程造成优势种的在时间上的更替，（不同的微生物，会在不同的时间段内繁盛起来。）
②培养的过程中也可以添加其他东西来筛选微生物，比如加一些酸性物质来筛选耐酸微生物。
这一步的实质是：水质变化会对生态系统造成影响，从而影响微生物的演替。
③开始培养以后，就需要每天早、晚两次取水在显微镜下观察，监视容器内的优势物种是什么？如果发现感兴趣的物种比较多，就需要在当时取一些水放到另一个容器中，继续培养。经过几次转移以后，培养物的纯度会提高许多。
这一步的实质是：在每一次物种的演替中，都在目标微生物比较繁盛的时间取样，从而一步一步提高目标微生物的纯度。
对混合培养法的评价：
混合培养法是纯培养的前置步骤，非常简便和省力。而且这种方法培养出来的微生物不是近亲繁殖的结果，所以不“娇气”，其中的微生物种群适应新环境能力较强，为以后的纯种培养奠定了基础。
2.3 纯培养
就是在一份培养液中只培养一种微生物。
具体步骤：
①用容器中的微生物制作不盖盖玻片的湿片，多做几个湿片，然后观察决定要取哪个物种。
②取一个新的凹玻片，上面滴加2~3滴培养液。
③用微细管从容器中吸出单个或多个目标物种，将其置于凹玻片内，然后将凹玻片放入潮湿房（见2.1）中，每天早晚两次在显微镜下观察凹玻片内的培养情况。如果培养液合适，藻类和原生动物一般是1天分裂1次，如果培养液不够可以继续滴加，约一周时间可以培养几十上百个，此时凹玻片的一个凹槽也已经快满了。
④然后准备一个小碟子，放入和凹玻片同样的培养液。然后将凹玻片内的微生物用吸管全部转移到碟子中，最后将小碟子放入潮湿房中继续培养。
⑤几天后小碟子也快满了，这时就可以粗放一些了，分批移入更大的容器培养即可。
对纯培养的评价：
纯培养是每一个爱好者的目标，但这个过程必须有足够的细心和耐心，培养只能逐步扩大规模，切忌揠苗助长。刚开始，在仅有单个或几个目标微生物的情况下，加入或添加培养液的量要严格控制，虫少尽量少加，虫多多加。另外，由于微生物对水质变化极为敏感，所以用于培养的用具一定要保证无毒且不会改变培养液水质。
三、纯培养的培养液配方参考
这里只提供我收集到的比较容易制作的配方。
需要注意的是，培养藻类主要是靠足够的CO2、无机矿物质和阳光，让藻类自己繁殖。而培养其他微生物则是喂食合适的饵料，而饵料一般是就培养基中生长的细菌。也就是说，培养除藻类外其他微生物的培养基首先应该是培养饵料的培养基。
如果没有特殊说明，下面说的水就是瓶装娃哈哈矿泉水。
3.1 藻类培养基
3.1.1 Pringsheim的土壤-水培养基
步骤：
①在没有施肥和打杀虫剂的肥沃土壤，富含腐殖质的地方采集40g土壤样品，然后添加到一个500mL的带盖子的耐热玻璃罐中。
②加水到玻璃罐的3/4处。
③加入0.125g碳酸钙。（如果培养水绵，请省略此步骤）
④盖紧盖子，连续3天，每天蒸玻璃罐1小时（可以稍微松一下盖子放气，但不能使空气进入其中污染培养基）。
⑤完成后冷却使用即可。
注意事项：
①如果培养裸藻，在蒸前添加1/4个豌豆子叶。
②如果培养硅藻，每L培养液添加10-30mg九水硅酸钠。
③大多数藻类在中等光线下生长旺盛，比如朝北的窗户。
④温度请保持在18-27℃。
⑤每两周补充一次新鲜的培养液。根据需要转移培养，避免过度拥挤。
3.2 原生动物培养基
培养原生动物的培养基首先应该是培养饵料的培养基。
3.2.1 麦粒浸出液
麦粒——用于草履虫：60~70粒 用于钟形虫：20粒 用于腹毛类纤毛虫：40粒
水：1000mL
步骤：煮麦粒，沸腾2~3分钟（时间不要太长，破坏麦粒的同时，要保留细菌芽孢），冷却后放置几天即可（繁殖细菌作为微生物的饵料）。这种麦粒水养殖的细菌可以作为下面培养基的菌种。
3.2.2 BLEY培养基（大麦叶和蛋黄培养基）
步骤：
①配制BL溶液：将3g大麦叶加入1000mL水中，边搅拌边加热，煮沸10分钟后取上清液。
②配制EY溶液：将9g煮鸡蛋的蛋黄碎末加入1000mL水中，边搅拌边加热，煮沸10分钟后取上清液。
③将两溶液1:1混合，再加入混合液体积两倍的水（混合液 : 水=1:2）。
（④分装前可以先用稀盐酸或稀氢氧化钠将pH调节到6.8。）
⑤分装到带盖玻璃瓶中，盖紧盖子，连续3天，每天蒸1小时灭菌（可以稍微松一下盖子放气，但不能使空气进入其中污染培养基）。
注意事项：
这种彻底（巴氏）灭菌的培养基，需要接种饵料菌种。可以用3.2.1麦粒浸出液作为菌种。
3.2.3 LE培养基（生菜叶和蛋黄培养基）
步骤：
**（1）**配制L溶液：
①将新鲜生菜内部的浅绿色叶子撕下来备用，注意挑选无划痕无破损没变质的新鲜叶片。
②烤盘上面放一层锡纸，将生菜叶放到上面，烤箱90℃烘烤16~18小时，成功时叶片呈棕黑色。
③将3g干燥叶片放入1000mL水中加热，边搅拌边沸腾30min，取上清液备用。
**（2）**配制E溶液：在1L水中加入3g煮鸡蛋的碎蛋黄，边搅拌边沸腾30min，取上清液备用。
**（3）**将两溶液1:1混合，无需稀释，冷却备用。
**（4）**分装前可以先用稀盐酸或稀氢氧化钠将溶液pH调节到6.8。
**（5）**分装到带盖玻璃瓶中，盖紧盖子，连续3天，每天蒸1小时灭菌（可以稍微松一下盖子放气，但不能使空气进入其中污染培养基）。
注意事项：
这种彻底（巴氏）灭菌的培养基，需要接种饵料菌种。可以用3.2.1麦粒浸出液作为菌种。
3.2.4 稻草浸出液
干稻草（去叶，切成2cm长的小段）：5~10g
水：1000mL
步骤：煮稻草，沸腾5~10分钟，注意补加蒸发掉的水分，冷却后放置几天即可（繁殖细菌作为微生物的饵料）。这种稻草水养殖的细菌可以作为其他培养基的菌种。
3.2.5 米粒浸出液
米粒（糙米更好）：10g
水：1000mL
**步骤：**煮米粒，沸腾510分钟，注意补加蒸发掉的水分，冷却后备用（繁殖细菌作为微生物的饵料）。使用时用水稀释110倍。在培养原生动物的过程中，每隔几星期加入少许米粒。
3.2.6 豌豆浸出液
豌豆：5g
水：1000mL
**步骤：**煮豌豆，沸腾5~10分钟，注意补加蒸发掉的水分，冷却后备用（繁殖细菌作为微生物的饵料）。使用时用水适当稀释。在培养原生动物的过程中，每隔几星期加入少许豌豆。